浙江理工大学学报,第26卷,第5期,2009年9月

JournalofZhejiangSci-TechUniversity

Vol.26,No.5,Sept.2009

文章编号:1673-3851(2009)05-0663-05

含RGD肽段重组丝蛋白的纯化与表征

潘明利a,b,吴娟红,沈　凯,范科杰,吴罗杰,姚菊明bbbba,b

(浙江理工大学,a.先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室;b.材料与纺织学院,杭州310018)

　　摘　要:利用基因工程方法将含RGD的氨基酸序列连接到桑蚕丝素蛋白中,设计并合成具有[TS(GAGAGS)5GAGYTGRGDSPAGYGAGVGAS]4一级结构的重组丝蛋白。探讨其盐析纯化的工艺条件。结果表明,重组丝蛋白相对合理而且易操作的纯化条件为:pH=6,37℃,硫酸铵在溶液中的饱和度为20%时进行第一步盐析;然后在pH=6,37℃,硫酸铵在溶液中的饱和度为40%时进行第二步盐析。利用该工艺条件,可以低成本、高效率地生产重组丝蛋白。

关键词:基因工程;丝蛋白;RGD;盐析;两步法

中图分类号:Q503　　　文献标识码:A

0　引　言

桑蚕丝除了作为纺织原料外,由于其优越的力学性能和相对良好的生物相容性,近年来,以丝素蛋白为基材的各种细胞生长支架材料的研究应运而生,成为组织工程中的热门研究领域[1,2]。桑蚕丝素蛋白的分子一级结构具有高度的重复性,其中70%由GAGAGS氨基酸序列组成,是丝素蛋白结晶区域的主要构成单元,为蚕丝蛋白提供良好的热稳定性、强度和弹性模量;而GAGAGY、GAGAGVGY等序列组成丝素蛋白的半结晶区,为蚕丝蛋白提供良好的伸展能力和弹性[1,3]。随着对桑蚕丝素蛋白的基因和分子结构的深入研究,利用基因重组方法来合成类丝状蛋白质材料已经成为可能。另一方面,作为组织工程用材料,细胞与细胞外基质或细胞培养的支架材料等的粘附是细胞生存与增殖所必需的,这种粘附主要通过一种被称作粘合素的物质来介导的。粘合素分子在材料结合时所识别的只是材料中由数个氨基酸组成的短肽序列,其中最重要的识别序列是基质或支架材料分子中的RGD序列,大多数粘合素都可识别RGD序列[4]。因此,在高分子材料表面固定RGD成为提高材料细胞粘附性能的有效手段。笔者利用基因重组技术把含有短肽RGD的序列连接到桑蚕丝素蛋白的典型肽段中,设计并合成具有[(GAGAGS)5GAGYTGRGDSPAGYGAGVGA]4一级结构的重组桑蚕丝蛋白,该重组蛋白既能保持天然桑蚕丝素蛋白的结构特征,同时又能提高材料的生物相容性。

由于重组丝蛋白的后续应用开发需要大量且具有一定纯度的原料,而外源基因在表达过程中必然伴有宿主以及其它基因的表达,所以从多种杂蛋白体系中纯化出目的融合蛋白显得尤其重要。目前,高纯度融合蛋白的制备多用亲和层析法,但亲和层析工艺复杂,成本较高且不适于大量制备。本课题组曾利用盐析法对重组丝蛋白的纯化进行了探讨[5],在此基础上,本研究采用了两步法盐析工艺,以期更有效地获得大量且纯度较高的重组丝蛋白,并通过扫描电子显微镜和傅立叶转换红外线光谱分析来对所制备的重组丝蛋白进行表征分析。

收稿日期:2009-02-16

基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET070763);浙江省新苗人才计划项目(2008R40G2060034)

作者简介:潘明利(1982-　),男,河南信阳人,硕士研究生,主要从事生物高分子的研究。通讯作者:姚菊明,电子邮箱:yaoj@zstu.edu.cn