664　　　　　　　　　　　　　　浙　江　理　工　大　学　学　报2009年　第26卷1　实　验

1.1　实验材料

核苷酸序列(委托上海申能博彩公司合成);琼脂糖、蛋白胨、酵母粉、琼脂粉、IPTG、三(羟甲基)氨基甲烷、β-巯基乙醇、咪唑、溴酚蓝、过硫酸铵等(上海申能博彩公司提供);卡那霉素、氨苄青霉素、溴化乙锭(上海生工);质粒pET-30a(+)和pUC118、菌株E.coliDH5α和BL21(Novagen);SpeⅠ,NheⅠ,BamHⅠ和HindⅢ等限制性内切酶、DNAMarker及蛋白Marker(大连宝生物有限公司);硫酸铵和尿素等试剂(分析纯,杭州汇普化工有限公司)。

1.2　实验方法

1.2.1　重组蛋白的诱导表达

表达质粒的构建在文献中已有详述[6]。将经过DNA测序验证后的表达质粒转化进感受态细胞E.coliBL21(DE3)中,并于37℃振荡过夜培养,次日取单菌落于3mL的含100μg/mL卡那霉素的TB培养基中过夜培养,按1%的接种量接种到发酵罐中,37℃培养至OD600=0.6～0.8时,加入终浓度为1mmol/L的IPTG诱导剂诱导表达4h。

1.2.2　重组蛋白的亲和层析纯化

经IPTG诱导表达4h后,冷冻离心收集菌体,将其重悬于裂解缓冲液(pH8,50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,10mmol/L咪唑)中,冰浴并超声波破碎后,离心(4℃,14500r/min,10min)收集上清,上样于Ni-NTA柱,用相同柱床体积的洗涤缓冲液(pH8,50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,50mmol/L咪唑)洗柱3次,以除去非特异结合的蛋白质,最后用同样柱体积的洗脱缓冲液(pH8,50mmol/LNaH2PO4,300mmol/LNaCl,250mmol/L咪唑)洗脱,收集目的蛋白溶液,并以SDS-PAGE来检测纯化结果。将纯化后的重组蛋白加入透析袋中,于4℃下透析2d,冷冻干燥后得海绵状的重组蛋白。

1.2.3　表达产物的SDS-PAGE检验

取Ni-NTA柱纯化后所获得的蛋白20μL与等体积的2×电泳上样缓冲液混匀,再于沸水中煮沸5min后,从其中取出12μL上样。以80V的电压进行SDS-PAGE电泳检验(12%的分离胶和5%的浓缩胶),直至指示的溴酚蓝到达浓缩胶时,改换电压至120V继续电泳直到溴酚蓝迁移到凝胶底部时停止电泳。电泳结束后,取出胶,将其浸入染色液中,摇床振荡染色40min,然后取出胶,放入脱色液中同样振荡直至脱去底色为止。

1.2.4　重组蛋白等电点的测定

取适量经亲和层析纯化并透析后所得目的蛋白溶液,分别用HCl和NaOH调整目的蛋白溶液pH值至2、4、5、6、7、8、11、13,用紫外分光光度计(DU530,Beckman公司)测定不同pH值溶液的透光率(λ=280nm)。

1.2.5　

硫酸铵盐析沉淀

菌体重悬于裂解缓冲液,并冰浴超声波破碎,离心

收集上清。根据影响盐析的工艺参数,本研究首先在

37℃,pH=6的条件下以硫酸铵在蛋白溶液中的饱和度

作为考察对象,进行第一步盐析,并按照上文1.2.3所

述的SDS-PAGE方法来检测盐析纯化的结果。在分析

第一步盐析结果的基础上,最终选定第二步盐析的工艺

参数,并确定两步盐析的工艺流程(见图1)。在两步盐

析的过程中,考察了37℃、室温(20℃)和4℃3个温度下图1　重组丝蛋白两步法盐析工艺流程图

不同硫酸铵饱和度对目的蛋白盐析的效果。如图1所示:首先取3g湿菌体混匀于15mL裂解缓冲液中,并将其置于冰浴中经超声波细胞破碎之后,离心收集上清,调pH值至6,再将上清等分12份,分3组;向每组上清中添加(NH4)2SO4至20%饱和度,并分别于4℃、室温(约20℃)和37℃静置2h进行第一次盐析;然后再离心收集上清,并向每组上清中依次添加(NH4)2SO4至30%、40%、50%、60%饱和度,并分别于4℃、室温h,