302 中草药　ChineseTraditionalandHerbalDrugs　第41卷第2期2010年2月

114　细胞生长测定:悬浮培养细胞经400目不锈钢

PQX多段人工气候箱中进行继代培养,温度为25

℃,光照和黑暗均为12h/d,光照1000lx,愈伤组

织8～10d继代一次,经过半年的驯化培养得到无性细胞系[5,6]。113　细胞悬浮培养体系的建立:将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转移到液体培养基中,置于摇床中进行悬浮培养,摇床转速110r/min,培养温度25℃,全天光照,光照强度为1000lx,培养1周后,培养液中即有悬浮单细胞或小细胞团出现。继代培养时,加入等量的新鲜培养液,摇匀,稍静置,待大细胞团沉降后分瓶,不需滤过,即可得到不含大细胞团块的培养物。这样通过3～4次继代培养,即可得到只含单细胞或小细胞团的培养物。

筛网滤过,蒸馏水洗涤3次,称得细胞鲜质量,50℃烘干至恒重即得干质量,计算细胞生长率[细胞增长率=(收获细胞量-接种细胞量)/接种细胞量×100%]。

115　绿原酸的提取及测定:见文献报道[7]。2　结果与分析211　培养条件优化

21111　基本培养基及激素浓度筛选:由于液体环境

下,植物细胞的生长状态与固体培养中并不相同,因此在悬浮细胞系建立后,进行L9(34)正交设计优化1、2表1　Table1　Resulttest

试验号

1

23456789

因　素

基本培养基类型

MS

MS　　B5　N6　N6　N6　311551492188(13161)(23187)(12176)

3333

生物量/

/( L-1)

013

016110016110013110013016

(g L-1干质量)3131±01142195±01163119±01245195±01125190±01074163±01103118±01182127±01103120±0118

333

绿原酸/

(mg L-1)14144±0152

12181±014613158±014225190±017426104±018219167±014014128±01449169±015214130±0162

/(-1)

1015015110115015110115411531713167(18121)(16118)(15185)

333

　K1　　K2　　K3　

R

()()

3

3140410341090169

(14160)(17167)(17197)

(3137)

3

　　　　3生物量(g/L)和绿原酸产量(mg/L)(括号内)

　　　　3biomass(g/L)andchlorogenicacid(mg/L)(inparenthesis)

表2　方差分析

Table2　Analysisofvariance

因　素

培养基类型

萘乙酸

62苄氨基嘌呤显著性

离差平方和

12137(229150)0142(9177)3()3

3

平均方差

6119(114175)30121(4189)3()3

F值显著性显著(显著)33　　不显著(不显著)33不显著(不显著)33

26189(20133)30191(0187)3()3

α=0105)　　　　3生物量(g/L)和绿原酸产量(mg/L)(括号内);　33因子对生物量和绿原酸产量(括号内)的显著性(　　　　3biomass(g/L)andchlorogenicacid(mg/L)(inparenthesis)

　　　　33significantdegreeofbiomassandchlorogenicacid(inparenthesis)atα=0105

　　结果表明,培养基的种类对细胞生物量的增长

和绿原酸的合成起很大的作用。B5培养基更有利于杜仲细胞的生长和绿原酸的合成,同时通过对细胞活力和褐化情况的观察和测定,发现虽然杜仲细胞在B5培养基中有一定程度的褐化现象,但是收获时细胞的活力仍然较高,说明细胞仍然有很大的增长潜力;在MS、N6培养基中的悬浮细胞虽然褐化程度很轻,但细胞增长缓慢,绿原酸合成量也相对

偏低,同时收获时细胞活力也较低。说明B5是杜仲悬浮培养的一种比较优良的培养基。结果还表明激素对细胞生物量的增长和绿原酸的合成影响均不太明显,且016%、110%的62BA对于杜仲的生长和绿原酸合成几乎没有区别。通过综合分析,确定最终的杜仲悬浮培养基为B5+015mg/LNAA+016mg/L62BA。21112　碳源种类筛选及浓度优化:碳源是细胞生长