4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定

第39卷 第4期 海 洋 与 湖 沼

Vol.39, No.4 2008年

7月

OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA

July, 2008

* 国家高技术研究发展计划(863计划)项目, 2006AA100313号; 国家重点基础研究发展规划(973)项目, 2006CB101806号。李海兵, 硕士, E-mail :lihaibing8@http://www.mianfeiwendang.com 、lihaibing8@http://www.mianfeiwendang.com

① 通讯作者: 宋晓玲, 研究员, E-mail :songxl@http://www.mianfeiwendang.com 收稿日期: 2007-03-25, 收修改稿日期: 2007-05-19

4株对虾肠道益生菌的筛选及鉴定*

李海兵1, 2 宋晓玲1①

韦 嵩1, 2 李 赟2 兰 萍1

(1. 中国水产科学研究院黄海水产研究所 青岛 266071; 2. 中国海洋大学生命科学与技术学部 青岛 266003)

提要 采用体外拮抗试验的方法, 先从不同生长阶段的对虾肠道中分离的96株细菌中筛选出4株对病原菌(鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌)有拮抗作用的细菌; 进一步通过固体扩散法和液体混合法确定LV060806、LV060808的产物对鳗弧菌有明显抑制作用, LV060806、LV060815的产物对副溶血弧菌有明显抑制作用, LV060810、LV060815的产物对哈维氏弧菌有明显抑制作用。溶血试验证实这些菌株不产生溶血素, 不具有潜在的致病性; 动物安全性实验证实菌株浓度在106 cfu/ml 以下对实验对虾无明显的毒害作用。随后测定了其16S rRNA 基因序列, 分析了相关细菌相应序列的同源性, 构建了系统发生树, 结合菌株表型特征和生理生化特性最终鉴定结果为:LV060806、LV060808为Vibrio natriegens ; LV060810、LV060815为V. alginolyticus 。 关键词 益生菌, 筛选, 鉴定, 抑制作用, 安全性实验 中图分类号 S963.73

20世纪, 抗生素的发现促进了人类医学的巨大进步, 自此抗生素成为抗菌治病的首选药物。大量的抗生素被广泛应用, 使动物养殖业尤其是水产养殖业不断受益。在药物和技术不断革新的基础上, 高密度、集约化、规模化、工厂化的养殖模式日趋成熟, 水产动物养殖业一度发展迅速(Grave et al , 1995)。但随之而来的病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶化、病原耐药性增强、养殖动物药物残留等问题也日益为人们所关注(Sambasivam et al , 2003)。开拓和发展符合环境友好和可持续发展战略的病害防治技术和产品已经成为水产养殖业的迫切需求(Pauly et al , 2002)。

益生菌(probiotic bacteria), 特别是来源于对虾内外环境的益生菌, 由于其在改善养殖水环境、抑制病原微生物的生长、改善对虾健康状况、促进对虾生长、提高饲料利用率等方面的突出作用, 引起越来越多的关注(Gatesoupe, 1999)。对虾益生菌的筛选、应用和作用机制的研究, 成为海洋微生物研究的重点(李继秋等, 2006; 申玉春等, 2007; Balc ázar et al , 2007)。作者从健康的中国对虾及凡纳滨对虾肠道内

分离筛选了几株具有抑制病原菌作用的拮抗菌, 并对其进行了分类学鉴定及安全性试验, 以期为功能益生菌的应用、高效免疫活性物质的开发以及对虾微生态制剂的研发奠定重要基础。

1 材料与方法

1.1 细菌的分离与培养

从健康的不同生长阶段的中国对虾(Penaeus chinensis )及凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei )肠道内, 分离到96株对虾体内细菌作为体外拮抗试验的待测菌株。指示菌株为本实验室分离和鉴定的对虾病原菌株, 包括鳗弧菌(Vibrio anguillarum )、哈维氏弧菌(V. harveyi )、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus ), 以及金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus )和微球菌(Micrococcus cohn )。待测菌株、指示菌株均用2216E 海水琼脂培养基常规培养, 并用含15%甘油的2216E 液体培养基保存于?80℃。 1.2 拮抗菌的筛选

参照文献(Smith et al , 1993), 将活化后的指示菌

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