土壤酶测定方法

土壤酶测定方法

芳基酰胺酶 Arylamidase (EC 3.4.11.2)

试剂:

1、THAM缓冲液(0.1 M,pH 8.0):2.44 g 三羟甲基氨基甲烷溶于50 mL水中,用0.05 M H2SO4滴定调节pH,加水稀释溶液至200 mL。

2、L-leucine β-naphthylamide solution L-亮氨酸β-萘胺(8.0 mM)(2 mM):称取0.2342 g L-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水,定容至100 mL。

3、Ethanol 乙醇:(95%)

4、Acidified ethanol 酸化乙醇(0.26 M HCl):4.32 mL浓HCl加入乙醇中,用乙醇定容至200 mL。

5、p-Dimethylaminocinnamaldehyde solution 对二甲氨基肉桂醛溶液 (0.6 mg/mL):0.12 g 对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇,用乙醇定容至200 mL。

6、标准液β-萘胺溶液(β-naphthylamine)(125 ug/mL):称取12.5 mg β-萘胺,75 mL蒸馏水,5 mL乙醇,用蒸馏水定容至100 mL。

7、β-萘胺标准曲线:分别吸取1,2,3,4,5,6 mL标准液β-萘胺溶液(125 ug/mL)与25 mL容量瓶,定容。标曲溶液浓度分别为:5,10,15,20,25,30 ug/mL β-萘胺 。

步骤:

1、称取1 g土壤(风干,<2 mm)于25 mL 三角瓶,加入3 mL 0.1 M 的THAM缓冲液(pH 8.0),1 mL 8.0 mM 的L-亮氨酸 β-萘胺盐酸盐。三角瓶涡旋几秒,混匀,密封,放置在震荡培养箱1 h(37oC)。

2、 培养结束后,加入6 mL乙醇(95%)终止反应,土壤悬浮液立即混匀,转移至离心管,在17000xg离心1 min。

3、将上层清液转移至测试管,阻止基质的进一步水解。吸取1 mL上层清液至另一个测试管,加入1 mL乙醇,2 mL 酸化乙醇,2 mL对二甲氨基肉桂醛溶液,混合溶液涡旋混匀,红色偶氮化合物在540 nm下比色。

4、当红色偶氮化合物的浓度超过最高浓度的标准β-萘胺溶液,能整除的红色偶氮化合物用乙醇稀释,直到在表曲线上。按照每1 mL标曲溶液,加入1mL乙醇,2 mL酸化乙醇,2 mL对二甲氨基肉桂醛。

5、对照处理,1 mL的基质在培养结束后加入。

参照方法来自于:Acosta-Mart ´Nez V, Tabatabai M A. Arylmidase Activity of Soils [J]. Soil

Science Society of America Journal, 2000, 64:215-221

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