蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理.

蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理.

蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理

聚丙烯酰胺凝胶,是由丙烯酰胺单体(Acr)和少量的交联剂N,Nˊ-甲叉双丙烯酰胺(Bis)在催化剂(过硫酸胺或核黄素)和加速剂(N, N,NˊNˊ-四甲基乙二胺)的作用下聚合交联成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶为支持物的电泳称聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。具有机械性能好、化学性能稳定、灵敏度好、分辨率高的优点。PAGE应用十分广泛,可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量和少量制备,还可测定分子量和等电点等。

PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类。前者电泳体系中缓冲液pH及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场中的泳动主要靠电荷和分子筛效应;后者电泳体系中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度是不连续的,带电颗粒在电场中的泳动不仅主要靠电荷和分子筛效应,还有浓缩效应。

(1)凝胶对样品分子的筛选效应(分子筛效应)

电场中,颗粒小、呈球形的样品分子泳动速度快;颗粒大、形状不规则的分子通过凝胶空洞时受到的阻力大,泳动慢。

(2)不连续系统对样品的浓缩效应

凝胶层的不连续性:不连续系统的凝胶包括浓缩胶和分离胶。浓缩胶的孔径大,分离胶的孔径小。在电场的作用下,蛋白质颗粒在大孔胶中泳动时遇到的阻力小,移动快。而在小孔胶中泳动时遇到的阻力大,移动慢。因此,在两层凝胶的交界处,由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。 缓冲液离子成分和pH的不连续性:在两层凝胶中均有Tris和HCl。Tris的作用是维持溶液的电中性及pH。HCl在一定pH条件下易解离出Cl- ,它在电场中迁移率大,走在最前面,故称为快离子或前导离子。电极缓冲液中的甘氨酸在pH8.3的缓冲液中解离度很小,仅为0.1-1%,因而在电场中迁移率很小,称为慢离子或尾随离子。血清中,大多数蛋白质pI在5.0左右,在pH8.3或6.7时均带负电荷,在电场中均移向正极,其有效迁移率介于快慢离子之间,于是蛋白质就在快慢离子间形成的界面处,被浓缩成极窄的区带。当进入pH8.9的分离胶时,甘氨酸解离度增加,其有效迁移率超过蛋白质,因此氯离子和甘氨酸离子沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大,被留在后面,然后分离成多个区带。此外,电泳体系中电位梯度的不连续性对样品的浓缩和迁移也具有一定作用。

(3)电荷效应

在分离胶中,各种血清蛋白所带静电荷不同,而有不同的迁移率。表面电荷多,则迁移快,反之则慢。因此各种蛋白质按照电荷多少、分子量大小及分子形状以一定顺序排成一个个区带。不连续PAGE所具有的分子筛效应、浓缩效应和电荷效应大大提高了它的分辨率。

电泳后蛋白质染色目前常用的是考马斯亮蓝法,其比氨基黑染色法灵敏度高,可以进行定量扫描,比银染法简便。

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